Ngày 24 Tháng 3, 1860, Naosuke bị ám sát ngay bên ngoài cồng vào Lâu đài Edo (tức hoàng cung Tokyo ngày nay).[1] Dù đã có mật báo cho biết tính mệnh ông bị đe dọa, Naosuke đáp rằng "Sự an toàn của riêng tôi là không là gì khi tương lai quốc gia lâm nguy."[5]

Ngay ở cổng vào thành bọn rōnin của phiên Mito đã mai phục sẵn 17 tên, lại có cả Arimura Jisaemon (有 村 次 左衛 門), một samurai từ phiên Satsuma góp sức.[6] Họ ùa ra tấn công đoàn hộ vệ khiến các vệ sĩ của Naosuke dàn ra chắn phía trước nhưng đó chỉ là hỏa mù vì hung thủ thừa lúc chỉ mình Naosuke trong cỗ kiệu, đã khai hỏa bắn một phát bằng khẩu Colt 1851 khiến Naosuke trúng đạn. Liền theo đó Arimura nhảy vào giết Naosuke, chặt lấy thủ cấp rồi bỏ chạy ra ngoài. Arimura sau tự mổ bụng mình tự vẫn (seppuku) để tiệt manh mối. Oái oăm thay khẩu súng định mệnh đó là một phiên bản nội chế của khẩu Colt mà Matthew Perry đã dâng tặng Mạc Phủ năm 1858.

Bọn phiên thần giết Naosuke còn ra thông cáo dẫn giải lý do sát hại:

Nhận thấy rằng từ khi ngườ Mỹ đến Uraga đòi thông thương, Mạc phủ đã thay đổi đường lối, không những phản lại lợi ích của đất nước mà còn làm nhơ nhuốc đến quốc thể khi giao hảo với bọn ngoại nhân, cho chúng vào cung, ký kết bao nhiêu điều bãi bỏ các tiền lệ cấm đạo Kitô... giờ đây cho bọn tà đạo xây nhà thờ và lại cho đại sứ chúng cư trú... Do đó, ta thay Trời trừng phạt tên ác nhân, làm tròn nhiệm vụ chống bỏ cường quyền

— Thông cáo của nhóm Sakuradamon.[7]

Tin Naosuke bị giết lan rất nhanh nhưng vì phương tiện truyền tin còn hạn hẹp nên bên Tây phương không biết gì mà phải tàu thuyền ngoại quốc vượt Thái Bình Dương báo tin về đến Mỹ khi cập bến San Francisco. Tin sau đó chạy bằng ngựa sang thủ đô Washington đến ngày 12 tháng 6 tức gần ba tháng sau thì phái đaòn ngoại giao của Nhât tại Mỹ mới được tin Naosuke bị giết.[8]